Timing

实验

RNA folding

1. 在 12 μl 无菌 H2O 中加入 10 pmol RNA（小 RNA 工作流程）或 500 ng（扩增子和随机工作流程）到 0.65 ml 反应管中。

2. 将RNA在95°C孵育2分钟，然后立即将其置于冰上至少2分钟。

3. 加入 6 μl 3.3×折叠缓冲液，并通过移液彻底混合。

4. 让RNA在所需温度（通常为37°C）下折叠20分钟。
我们描述了适用于许多小的体外转录RNA的简单折叠条件。从病毒或细胞中轻轻提取的RNA通常不应变性和重新折叠。对于此类示例，请跳至步骤 5。

RNA modification

1. 将 1 μl 100 mM 1M7（用于 （+） 1M7 反应）和 1 μl 纯 DMSO（用于 （-） 反应）分装到单独的 0.65 ml 反应管中。

2. 将步骤4中的9μl折叠RNA加入（+）和（-）反应管中，通过移液剧烈混合，并在所需温度下孵育5个1M7水解半衰期（37°C时∼75秒）。

将 RNA 溶液添加到较小的试剂体积中，以确保彻底、快速混合。在加入 RNA 后立即彻底混合反应组分非常重要。将 RNA 添加到一个反应中，混合并开始孵育，然后再进行下一个反应。

3. 反应进行完成后，将反应管放在冰上，同时进行变性控制反应（步骤8-11）。

4. 将 5 pmol 新鲜 RNA 加入 3 μl 无菌水、5 μl 100% 甲酰胺和 1 μl 10× DC 缓冲液中至 0.65 ml 反应管中。混合均匀。

5. 将混合物在95°C孵育1分钟，使RNA变性。

6. 将 1 μl 100 mM 1M7 加入干净的 0.65 ml 反应管中用于直流反应。

不要在95°C下预孵育SHAPE试剂。 在高温下，竞争性水解反应进行得很快;试管中的水分会降低SHAPE试剂的有效浓度。

7. 向DC反应管中加入9μl变性RNA，充分混合并在95°C下孵育1分钟。将直流反应管放在冰上，同时准备G-25离心柱。

8. 用不含RNase的水使每个样品的总体积达到50μl，并从（+），（-）和DC反应中纯化RNA。对于长度超过 200 nt 的 RNA，使用单独的 RNeasy Mini 色谱柱。对于短于 200 nt 的 RNA，使用单独的 G-25 离心柱。在每种情况下，请按照制造商的说明进行操作。

修饰的RNA可以在-20°C下储存至少6个月。

DNase treatment

步骤 13-15 对于转录后用 DNase 处理的体外转录 RNA 是可选的。然而，DNase处理对于从细胞中分离的RNA至关重要，因为基因组DNA污染可能会改变表观突变率。

1. 对于从细胞或病毒粒子中分离的RNA，用不含RNase的水将每个样品（来自步骤12）的总体积达到88μl，然后按如下方式组装用于DNase处理的组分：

2. 将DNase反应在37°C孵育30分钟。

3. 根据制造商的说明，使用单独的RNeasy mini离心柱对每个样品进行DNase反应纯化RNA。

Reverse transcription

1. 可以使用选项 A 或 B 执行此步骤，具体取决于用于逆转录的引物类型。对于小 RNA 和扩增子工作流程，使用选项 A;对于随机器工作流，请使用选项 B。有关工作流程的更多信息，请参阅简介的“程序概述”部分。
1. 使用特异性引物进行逆转录
1. 加入 10 μl （+）、（−） 和 DC RNA（来自步骤 12;步骤15如果进行了DNase处理）以分离0.65-ml反应管。向每个试管中加入 1 μl 2 μM 逆转录引物。在65°C孵育5分钟，然后在冰上冷却。
2. 向每个试管中加入8μlMaP缓冲液。充分混合并在42°C下孵育2分钟。
3. 向每个试管中加入 1 μl SuperScript II 逆转录酶并充分混合。立即继续执行步骤 17。

反应条件仅针对 SuperScript II 逆转录酶进行了优化。其他逆转录酶和衍生物未经测试，不应使用。
2. 使用随机引物进行逆转录
1. 加入 10 μl （+）、（−） 和 DC RNA（来自步骤 12;步骤15如果进行了DNase处理）以分离0.65-ml反应管。向每个试管中加入 1 μl 200 ng/μl 随机引物。在65°C孵育5分钟，然后在冰上冷却。

每次逆转录反应至少需要 50–100 ng RNA。MaP 条件下的逆转录效率低于标准条件下的逆转录效率。
2. 向每个试管中加入8μlMaP缓冲液。充分混合，并在25°C下孵育2分钟。
3. 向每个试管中加入 1 μl SuperScript II 逆转录酶并充分混合。

反应条件仅针对 SuperScript II 逆转录酶进行了优化。其他逆转录酶和衍生物未经测试，不应使用。
4. 将反应在25°C孵育10分钟，然后立即进行步骤17。

2. 将反应管在42°C孵育3小时。

3. 将反应加热至70°C15分钟以灭活SuperScript II逆转录酶。将它们放在冰上或保持在4°C。

如果要通过第二链合成（随机工作流程）将 cDNA 转化为 dsDNA，请将逆转录产物保持低温（但不要冷冻）。第二链合成要求在逆转录过程中产生的退火RNA-DNA杂交体是完整的。

逆转录酶产物可以在4°C下保存过夜。

4. 根据制造商的说明，使用单独的 G-25 离心柱从 （+）、（-） 和 DC 反应中纯化 cDNA。

纯化的cDNA可以在-20°C下储存至少1年。

Library preparation

1. 该步骤可以使用选项 A、B 或 C 执行，具体取决于用于逆转录的 RNA 大小和引物类型。对于小 RNA 工作流程，使用选项 A; 对于扩增子工作流程，使用选项 B; 对于随机工作流，请使用选项 C。
1. Small RNA library preparation小RNA文库制备
1. 在薄壁PCR板中，为每种实验条件设置步骤1 PCR，如下表所示;有关适当的引物序列，请参见表 3 和表 4。为减少移液过程中的错误，应制备除cDNA以外的所有反应组分的预混液。将 cDNA 和预混液混合在 PCR 板中。

Table 9表9

Component	Amount (μl)	Final concentration最终浓
Q5 reaction buffer (5×) Q5反应缓冲液（5×）	10	1×
dNTPs (10 mM each) dNTP（每个10mM）	1	0.2 mM each每个 0.2 mM
Step1Fwd primer (25 μM) Step1Fwd 引物 （25 μM）	1	0.5 μM
Step1Rev primer (25 μM) Step1Rev 引物 （25 μM）	1	0.5 μM
cDNA (from Step 19) cDNA（来自步骤 19）	5
Q5 hot start DNA polymerase (2 U/μl) Q5热启动DNA聚合酶（2U /μl）	0.5	0.02 U/μl
Nuclease-free water 无核酸酶水	31.5
Final	50 (for one reaction)

2. 将PCR板放入预热的热循环仪中，并循环执行以下程序：

Table 10

Step	Denature	Anneal	Extend
1	98 °C, 30 s
2–6	98 °C, 10 s	65 °C, 30 s	72 °C, 20 s
7			72 °C, 2 min


请务必根据所使用的 RNA 特异性引物序列计算适当的退火温度。NEB在线退火温度计算器（http://tmcalculator.neb.com）效果很好。
3. 根据制造商的说明，使用单独的 PureLink PCR 微离心柱从 （+）、（−） 和 DC 反应中纯化步骤 1 PCR 产物。在10μlH2O中洗脱。
4. 在薄壁PCR板中，为每种实验条件设置步骤2 PCR，如下表所示。为减少移液错误，应制备除第 1 步 PCR 产物和带条形码的 UniFwd 引物以外的所有反应组分的预混液。将预混液、步骤 1 PCR 产物和 UniFwd 引物混合在 PCR 板中。

每个 （+）、（−） 和 DC 样品必须使用唯一的条形码序列。请务必仔细记录每个样品的条形码索引。

Table 11

Component	Amount (μl)	Final concentration
Q5 reaction buffer (5×)	10	1×
dNTPs (10 mM each)	1	0.2 mM each
UniFwd primer (25 μM)	1	0.5 μM
UniRev primer (25 μM)	1	0.5 μM
Purified step 1 PCR product	10
Q5 hot start DNA polymerase (2 U/μl)	0.5	0.02 U/μl
Nuclease-free water	26.5
Final	50 (for one reaction)

5. 将PCR板放入预热的热循环仪中，并循环执行以下程序：

Step	Denature	Anneal	Extend
1	98 °C, 30 s
2–26	98 °C, 10 s	65 °C, 30 s	72 °C, 20 s
27			72 °C, 2 min

6. 让 Agencourt AMPure XP 珠子在工作台上达到室温。使用前立即彻底涡旋珠子。
7. 从热循环仪中取出PCR板，向每个反应孔中加入45μlAgencourt AMPure XP珠。上下移液 10 次以充分混合，然后在室温下将板孵育 5 分钟而不摇晃。
Table 5 SHAPE-MaP Troubleshooting table.

Step	Problem	Possible cause	Solution
20A(vii)	Low library yield 文库产量低	Size selection is too stringent 尺寸选择过于严格	Use a 1:1 or 1.2:1 ratio of beads to sample 使用 1：1 或 1.2：1 的微珠与样品比例
20C(iv)	Low dsDNA yield dsDNA 产量低	Poor cDNA yield from reverse transcription 逆转录 cDNA 产量低	Use more RNA; do not exceed 5 μg 使用更多的RNA;不要超过 5 μg
			Increase the RT primer concentration by 10-fold. For the Randomer Workflow this will result in shorter sequencing libraries 将RT引物浓度增加10倍。对于随机器工作流程，这将导致更短的测序库
21	Low library yield 文库产量低	Failed step 1 or step 2 PCR第 1 步或第 2 步 PCR 失败	Optimize PCR conditions for each reaction individually before performing them in sequence 在按顺序执行之前，单独优化每个反应的PCR条件
			Some RNAs amplify better with a different ratio of cycles between steps 1 and 2. Perform PCR using 20 cycles of step 1 and 10 cycles of step 2 在第 1 步和第 2 步之间的循环比例不同的情况下，一些 RNA 的扩增效果更好。使用步骤 1 的 20 个周期和步骤 2 的 10 个周期进行 PCR
22	Extra peaks are observed in the small RNA workflow library 在小RNA工作流程文库中观察到额外的峰	Nonspecific primers 非特异性引物	Re-design the [RNA-specific] and [RT primer] sequences of Step 1 primers with an online tool such as Primer-BLAST to avoid off-target binding. Test primers by performing step 1 PCR for 25–30 cycles and by verifying the product on a gel or Bioanalyzer chip 使用在线工具（如 Primer-BLAST）重新设计第 1 步引物的 [RNA 特异性] 和 [RT 引物] 序列，以避免脱靶结合。通过执行步骤 1 PCR 25-30 个循环并在凝胶或生物分析仪芯片上验证产物来测试引物
		Low step 1 PCR input 低步长 1 PCR 起始量	Increase the number of step 1 cycles to 20, and reduce step 2 PCR to 10 cycles 将第 1 步循环的数量增加到 20 个，并将第 2 步 PCR 减少到 10 个循环
		Incomplete conversion of step 1 product to step 2 product 步骤 1 产品到步骤 2 产品的转换不完整	Reduce the number of step 1 cycles or carry less step 1 product through to step 2 PCR减少第 1 步循环的数量或将较少的第 1 步产物带到第 2 步 PCR
24	Few reads align to the RNA of interest 很少有reads与目标RNA对齐	Nonspecific primers 非特异性引物	Re-design PCR primers (small RNA and amplicon workflows, see above); optimize RNA purification (randomer workflow) 重新设计PCR引物（小RNA和扩增子工作流程，见上文）;优化 RNA 纯化（随机工作流程）

8. 将PCR板放在96孔磁性支架上2分钟或直到上清液清除，然后小心地取出并丢弃上清液。
9. 将板仍放在磁性支架上，向每个孔中加入 200 μl 新鲜制备的 80% （vol/vol） 乙醇。请勿尝试重新悬浮珠子。孵育 30 秒，然后取出并丢弃乙醇。
10. 重复步骤20A（ix）两次。使用10μl移液器吸头除去每个孔底部残留的任何乙醇。
11. 将板仍放在磁性支架上，让珠子风干 15 分钟。
12. 从磁性支架上取下板。向每个孔中加入17μlH2O。上下移液器10次以充分混合，然后在室温下孵育2分钟。
13. 将板放在磁性支架上 2 分钟或直到上清液清除。
14. 小心地从每个孔中取出15μl含有DNA的上清液，并将其置于单独的1.7ml微量离心管中。
15. 继续执行步骤 24。
2. Amplicon library preparation扩增子文库制备
1. 在薄壁PCR板中，为每种实验条件设置PCR扩增，如下表所示。为减少移液错误，应制备除cDNA以外的所有反应组分的预混液。将 cDNA 和预混液混合在 PCR 板中。

Table 13

Component	Amount (μl)	Final concentration
Q5 reaction buffer (5×)	10	1×
dNTPs (10 mM each)	1	0.2 mM each
Forward primer (25 μM)	1	0.5 μM
Reverse primer (25 μM)	1	0.5 μM
cDNA (from Step 19)	5
Q5 hot start DNA Polymerase (2 U/μl)	0.5	0.02 U/μl
Nuclease-free water	31.5
Final	50 (for one reaction)

2. 将PCR板放入预热的热循环仪中，并循环执行以下程序：

Table 14

Step	Denature	Anneal	Extend
1	98 °C, 30 s
2–27	98 °C, 10 s	65 °C, 30 s	72 °C, 20 s
31			72 °C, 2 min


务必根据所使用的引物序列计算出适当的退火温度。NEB在线退火温度计算器（http://tmcalculator.neb.com）效果很好。
3. 根据制造商的说明，使用单独的 PureLink PCR 微离心柱从 （+）、（-） 和 DC 反应中纯化 PCR 产物。在10μlH2O中洗脱。
4. 通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪2100分析PCR产物。

PCR反应应产生预期大小的单条带。应优化反应条件，以获得纯反应产物。当无法避免脱靶产物时，建议进行凝胶纯化。
5. 量化每个反应的PCR产物，并产生0.2ng / μl的稀释度。
6. 在冰上解冻扩增子标记混合物、标记 DNA 缓冲液、Nextera PCR 预混液、Nextera XT index 1 引物和 Nextera XT index 2 引物。让 Neutralize Tagment 缓冲液在工作台上达到室温。在继续操作之前，请确保所有试剂都已彻底混合且无沉淀物。
7. 对于每个 （+）、（−） 和 DC 样品，按如下方式设置碎裂和标记反应：

Table 15

Component	Amount (μl)	Final concentration
Tagment DNA buffer	10
dsDNA from Step 20B(v) (0.2 ng/μl)	5	0.05 ng/μl
Amplicon Tagment mix	5
Final	20 (for one reaction)

8. 充分混合，然后密封板并放入预热的热循环仪中，并运行以下程序：

Table 16

Step	Incubate
1	55 °C, 5 min
2	10 °C, hold

9. 一旦样品达到10°C，从热循环仪中取出板并加入5μlNeutralize Tagment缓冲液。将样品充分混合并在室温下孵育 5 分钟以中和标记反应。
10. 对于每种 （+）、（−） 和 DC 条件，按如下方式组装 Nextera PCR 并彻底混合。
Table 17

Component	Amount (μl)
Tagmented DNA (from Step 20B(ix))	25
Nextera PCR master mix	15
Index 2 primer	5
Index 1 primer	5
Final	50 (for one reaction)


每个 （+）、（−） 和 DC 样品必须使用唯一的条形码序列。请务必仔细记录每个样品的条形码索引。
11. 密封PCR板，将其放入预热的热循环仪中，并通过以下程序进行循环：

Table 18表18

Step步	Denature变性	Anneal退火	Extend扩展
1	72 °C, 3 min72 °C，3 分钟
2	95 °C, 30 s95 °C， 30 秒
3–14	95 °C, 10 s95 °C， 10 秒	55 °C, 30 s55 °C， 30 秒	72 °C, 30 s72 °C， 30 秒
15			72 °C, 5 min72 °C，5 分钟


PCR反应可以在10°C下放置过夜或在2-8°C下储存长达2天。
12. 执行步骤20A（vi-xiv）。
3. Randomer library preparation随机器文库制备
1. 对于每个 （+）、（−） 和 DC 样品，用无核酸酶 H2O 将步骤 19 的 cDNA 体积调节至 68 μl。 设置第二链合成反应，如下所示：
Table 19
2. 将第二链合成反应在16°C的热循环仪中孵育2.5小时。
3. 根据制造商的说明，使用 PureLink PCR 微离心柱从第二链合成反应中纯化 dsDNA。在10μlH2O中洗脱。

纯化的dsDNA可以在-20°C下储存至少6个月。
4. 定量每个反应的dsDNA，并产生0.2ng / μl的稀释度。

使用许多商用紫外仪器很难准确定量低浓度的 DNA。强烈建议使用基于荧光的检测 （Qubit）。
TROUBLESHOOTING故障 排除
5. 执行步骤20B（vi-xii）。

如果在逆转录过程中使用了随机引物，请使用此选项。

Quality control and sample dilution

1. 使用 Qubit 荧光计或其他高灵敏度测定法测量文库浓度。

2. 根据制造商的说明，使用 Agilent 2100 生物分析仪评估文库大小分布。使用小RNA工作流程生成的文库应表现为单个定义明确的峰。使用扩增子工作流程生成的文库应具有 ∼250 bp 的大小下限和与输入扩增子相对应的长度上限。使用随机工作流程生成的文库的长度分布应在 ∼250 到 1,500 bp 之间（图 5）。

3. 使用选项 A（小 RNA 工作流程）或选项 B（扩增子工作流程或随机工作流程）计算文库摩尔浓度。目前的Illumina仪器需要至少2 nM的文库浓度。
1. 适用于小型 RNA 工作流程文库
1. 根据输入的 RNA 序列计算 dsDNA 的分子量，然后添加 81,000 g/mol 以考虑接头序列。使用该最终分子量和步骤21的质量浓度来计算库的浓度（以nM为单位）。
2. 用于扩增子和随机化工作流程库

Sequencing

1. 根据仪器说明在Illumina或其他测序仪上对文库进行测序。

配置序列器以生成解复用、适配器调整、FASTQ 格式的输出。

ShapeMapper analysis

1. 准备运行（步骤 25-29）。创建一个文件夹，并描述性地命名一个文件夹，该文件夹具有可用于 ShapeMapper 生成的中间文件的空间。这些中间文件的大小是输入排序读数大小的 ∼1.5 倍。此文件夹将称为“RUN”文件夹。

2. 检查此目录的路径中是否不存在空格（如果存在空格，则调用 Bowtie2 的 perl 脚本将失败）。

3. 将步骤 24 中未压缩的 FASTQ 排序读取文件 （.fastq） 复制或移动到 RUN 文件夹中。示例数据可在 Sequence Read Archive SRP052065 中找到。
1. 下载SRR1755103、SRR1755105、SRR1755074、SRR1755069、SRR1755068、SRR1755067

4. 为每个感兴趣的目标序列创建 FASTA 格式的序列文件 （.fa）。如果要分析示例数据，请将序列文件从 ShapeMapper 文件夹复制到 RUN 文件夹中。
1. 每个 FASTA 文件的第一行是“>”字符，后跟序列名称;
2. 剩下的几行是DNA序列;
3. 文件名必须与“>”字符后面的序列名称完全匹配;
4. “>”字符和序列名称之间不应有空格;并且您必须按顺序使用“T”，而不是“U”。
5. 使用所有大写字母进行排序。

5. 将 ShapeMapper 附带的 EXAMPLE.cfg 文件复制到 RUN 文件夹中，并为该文件指定新名称。

6. 使用文本编辑器编辑配置文件（步骤 30-35）。有关示例配置文件，请参见框 1。如果测序平台生成的FASTQ文件可能在读取开始时包含质量较差的碱基调用（例如，有时由HiSeq或NextSeq仪器生成的碱基调用），请将“windowSize”参数设置为“3”。这将允许“trimPhred”阶段使用窗口化的平均碱基调用质量分数，而不是单个碱基调用截止值。

7. 如果执行了配对端排序，请将“alignPaired”参数设置为“True”。

8. 如果执行了随机启动并且未使用Nextera试剂盒制备了cDNA文库，则将“randomlyPrimed”参数设置为“on”，将“primerLength”参数设置为引物的长度。然后，ShapeMapper 将忽略在 3' 读段末端的 'primerLength' +1 nt 内发生的突变（因为随机引物和天然序列之间的差异与 SHAPE 修饰的位点不对应）。如果使用标记（Nextera 试剂盒），即使随机引物实际上用于逆转录，也应将“randomlyPrimed”参数设置为“off”。Nextera方案涉及DNA末端的酶促切割，因此无需计算去除引物区域。

9. 如果使用Nextera试剂盒制备cDNA文库，我们建议将“maxInsertSize”设置为800（这对应于Bowtie2的“--maxins”参数）。否则，默认值 500 是合适的。

10. 将样本名称后跟对齐目标添加到“[对齐]”部分。如果 FASTQ 文件名不遵循 Illumina 命名规则，请使用所示的替代语法指定完整文件名。

11. 在“[profiles]”部分中指定应合并到反应性配置文件中的样品。配置文件名称由用户指定。

12. 执行 ShapeMapper（步骤 36-38）。打开命令行终端。

13. 浏览到 RUN 目录。

14. 启动 ShapeMapper。在本地计算机上，运行 ShapeMapper.py yourfile.cfg的命令
其中 'yourfile.cfg' 是配置文件的名称。或者，要提交到负载共享工具，请在yourfile.cfg ShapeMapper.py 运行命令 bsub -q day -n 6 -o run.out -R span[ptile=6]
此命令可能因特定集群配置而异。
预期输出：
有关运行进度或失败的信息将写入 'log.txt';
反应性配置文件将被写入输出文件夹中的“reactivity_profiles”子文件夹（表 2）。
显示SHAPE反应性与核苷酸位置关系的每个图谱的图像（图7）。
生成每个 RNA 的读取深度与核苷酸位置的关系图像（图 8）。
将生成突变率、读取深度、SHAPE 反应性和 s.e.m.（用于实验故障排除）的直方图（图 9）。
每个分析阶段的中间文件将被写入磁盘（表 2）。

在 12 核 2.93 GHz Dell C6100 服务器上分析示例 ShapeMapper 数据需要 20 分钟。这是<100,000 nt的靶RNA和单次MiSeq测序仪器运行产生的数据量的典型运行时间。较大的数据集或较长的目标序列会增加运行时间。

SuperFold analysis

1. 要对 RNA 结构进行建模，请在 SuperFold 中使用 ShapeMapper 生成的 .map 或 .mapd 文件（有关文件格式的描述，请参阅框 3），方法是键入以下命令。请注意，SuperFold 通常使用折叠窗口大小的默认设置运行。SuperFold.py 16SrRNA.map
预期成果：创建三个文件夹，即“fold_”、“partition_”和“result_”;每个下划线后面都是输入 .map 文件的名称和从标志的 MD5 哈希创建的短签名。用于折叠 RNA 的参数和运行状态将写入结果目录中的日志文件中。中间分区函数计算被写入“partition”目录。这些计算对于故障排除非常有用。如果运行成功完成，则可以删除这些内容。中间折叠被写入“折叠”目录。这些对于故障排除也很有用。如果运行成功完成，则可以删除这些内容。Shannon 熵和 SHAPE 分析、分区函数弧和扩展区域被写入 results 目录。反映香农熵、分割函数计算和最小自由能结构（.ct 格式）的文本文件被写入结果目录。Shannon 熵/SHAPE 区域的二级结构图形和连通性文件将写入结果目录内的 regions 子目录。