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RNA 的 SHAPE 修饰
将 SHAPE 亲电子试剂添加到折叠的 RNA（或病毒或细胞）中，然后孵育，直到试剂与 RNA 发生反应或通过用水水解而降解（五个水解半衰期，图 1b,c ）。两个对照反应平行进行：无试剂对照和变性对照。在无试剂对照反应中，折叠的 RNA 仅与溶剂（对于 SHAPE 试剂通常为 DMSO）一起孵育；这一重要的控制措施可测量 MaP 条件下逆转录酶的内在背景突变率，并且还可以检测某些自然发生的 RNA 修饰事件。在变性对照反应中，RNA 悬浮在含有甲酰胺的变性缓冲液中，并在 SHAPE 试剂修饰之前在 95 °C 下孵育。在此步骤中，核苷酸被相对均匀地修饰，所产生的位点特异性突变率在加合物诱导的突变检测中解释了微妙的序列和结构特异性偏差。因此，完整的 SHAPE-MaP 实验由三个反应组成：正试剂 (+)、负试剂 (−) 和变性对照 (DC)。
本协议中使用的标记 (Nextera) 文库制备要求样品中仅存在源自正在检测结构的 RNA 的双链 DNA (dsDNA)。因此，在逆转录和随后的文库制备步骤之前，分别完全去除细胞和体外转录样本中的基因组 DNA 和模板 DNA 至关重要。通过温和提取以维持二级结构而获得的细胞或病毒 RNA 应在 SHAPE 修饰后、逆转录前进行 DNase 处理。对于体外转录的RNA，可以在体外转录后立即方便地进行DNase处理。
MaP by reverse transcription.通过逆转录进行 MaP。
对 RNA 进行 SHAPE 修饰后，使用逆转录酶创建 MaP。此步骤将 SHAPE 加合物的位置和相对频率编译为 cDNA 序列中的突变。突变分析非常有效，大约 50% 的 SHAPE 加合物被检测为 cDNA28 中的突变。任何 RNA 的逆转录反应条件都相同，但研究人员对于 DNA 引物类型有两种选择。
小到足以在单个大规模并行测序读取中进行端到端测序（目前读取长度可达 600 nt）的 RNA 可以使用标准序列特异性 DNA 引物进行逆转录（standard sequence-specific DNA primers）。特异性引物还可用于探测大 RNA 的特定子区域（图 4，小 RNA 工作流程和扩增子工作流程）。使用基因或区域特异性引物还可以分析复杂 RNA 混合物中的特定稀有 RNA。这对于细胞内研究特别有用。对于大 RNA、整个转录组或多组分核糖核蛋白或长非编码 RNA 组件的分析，随机引物有助于在单个实验中均匀覆盖复杂的 RNA 状态（图 4，随机工作流程） 。使用适当的引物进行突变分析后，将使用这三个工作流程之一（图 4）进行文库构建。
Library construction and sequencing. 文库构建和测序
小 RNA 工作流程非常适合短 RNA 或大 RNA 的亚区，这些亚区足够短，可以通过单个未配对测序读段或两个配对的双端测序读段进行完全测序。使用此工作流程制备的文库反映了原始 RNA 的序列。在使用序列特异性引物进行逆转录后，纯化的 cDNA 在有限周期 PCR 反应中使用不完整的平台特异性接头“标记”。所得的dsDNA产物在第二次PCR反应中被纯化并进一步扩增，该反应完成了平台特异性接头并添加了多路检测所需的序列（参见试剂设置）。纯化后，测序文库大小一致，每个DNA分子都包含整个目标序列（图5a）。
图 5：作为工作流程函数的代表性库大小分布。
(a) 使用小 RNA 工作流程生成的 TPP 核糖开关文库的生物分析仪电泳图。主要产物左侧的小峰是未转化的步骤 1 PCR 产物。 (b) 通过扩增子工作流程从单个扩增子（虚线）构建的文库（实线）。该文库包含一些比原始扩增子稍大的 DNA，因为平台特异性接头被添加到接近全长的片段中。 (c) 通过随机器工作流程构建的库（实线）。第二链合成产生的 dsDNA 的大小（虚线）设定了文库大小的上限。
扩增子工作流程非常适合大的、低丰度的 RNA 或无法通过单次测序读取进行端到端测序的大 RNA 的子区域。逆转录后，使用序列特异性引物通过 PCR 扩增纯化的 cDNA。然后将所得的 dsDNA 进行酶促片段化，并用平台特定的接头和多重索引进行标记。以这种方式构建的测序文库的大小是可变的；每个分子都包含原始扩增子的片段（图 5b）。使用这种方法会丢失有关起源链的信息。通常，当使用扩增子工作流程构建测序文库时，用序列特异性引物引发逆转录。然而，如果研究人员希望为最初使用随机引物转化为 cDNA 的 RNA 特定区域生成测序文库，扩增子工作流程允许有针对性地“重建”文库。
当感兴趣的RNA较大（大于∼500 nt）且纯度相当高时，可以使用随机工作流程构建测序文库；例如，就病毒 RNA 基因组而言。随机工作流程还适用于分析非常复杂的系统，包括完整的 RNA 转录组。希望检查序列方向性未知的 RNA 的研究人员应使用替代的链信息保存方法（本协议中未描述）。使用适当的随机引物进行反转录后，纯化的 cDNA 转化为 dsDNA，然后进行酶促片段化，并使用平台特异性接头和多重索引进行标记。得到的测序文库大小可变，每个分子对应于原始RNA的一个片段（图5c）。
构建高质量SHAPE-MaP文库后，使用大规模并行测序仪对文库进行测序。该协议描述了与 Illumina 测序仪器兼容的文库的制备。然而，MaP 方法与任何具有高每核苷酸调用准确性的平台完全兼容。为了准确恢复核苷酸分辨率的结构信息，SHAPE-MaP 需要在感兴趣的 RNA 的所有区域具有高读取深度。
对于给定的 RNA，SHAPE-MaP 涉及生成在三种不同实验条件下处理的 RNA 的测序数据：正试剂、负试剂和变性对照。为了输入 ShapeMapper，这些样本可以单独测序，也可以一起测序并使用多重条形码（例如 Illumina TruSeq）进行解卷积。测序读数应输出为 FASTQ 文件；这种格式在现代测序平台中广泛使用。