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下面给出了所有三个工作流程所需的试剂的完整列表。根据工作流程，并非所有试剂都是必需的。
所需试剂列表
RNA at a concentration of 5 μM in 10 mM HEPES, pH 8.0
RNA 浓度为 5 μM，溶于 10 mM HEPES，pH 8.0
RNA must be prepared, stored and manipulated in an RNase-free environment. For best results, reagents should be of highest possible quality and reserved for RNA use only. RNA can be stored at −20 °C for at least 6 months. Avoid repeated freeze-thaw cycles. The 5 μM concentration is convenient for in vitro studies; however, much lower concentrations of RNA can be probed using the small RNA and amplicon workflows.
RNA 必须在无 RNase 的环境中制备、储存和操作。为了获得最佳结果，试剂应尽可能具有最高质量，并仅供 RNA 使用。 RNA可在-20°C保存至少6个月。避免反复冻融循环。 5 μM浓度方便体外研究；然而，使用小 RNA 和扩增子工作流程可以探测低得多的 RNA 浓度。
- Sodium chloride (NaCl, 5 M; Life Technologies, cat. no. AM9760G)
- 氯化钠（NaCl，5 M；Life Technologies，目录号 AM9760G）
- Magnesium chloride (MgCl2, 1 M; Life Technologies, cat. no. AM9530G)
- 氯化镁（MgCl2，1 M；Life Technologies，目录号 AM9530G）
- Potassium chloride (KCl, 2 M; Life Technologies, cat. no. AM9640G)
- 氯化钾（KCl，2 M；Life Technologies，目录号 AM9640G）
- Tris, pH 8.0 (1 M; Life Technologies, cat. no. AM9850G)
- Tris，pH 8.0（1 M；Life Technologies，货号 AM9850G）
- HEPES (Fisher BioReagents, cat. no. BP310-500)
- HEPES（Fisher BioReagents，目录号 BP310-500）
- EDTA, pH 8.0 (0.5 M; Life Technologies, cat. no. AM9260G)
- EDTA，pH 8.0（0.5 M；Life Technologies，目录号 AM9260G）
- Formamide, highly deionized (Life Technologies, cat. no. 4311320)
- 甲酰胺，高度去离子（Life Technologies，目录号 4311320）
- Manganese chloride (MnCl2, 1 M; Fisher BioReagents, cat. no. BP541-100)
- 氯化锰（MnCl2，1 M；Fisher BioReagents，目录号 BP541-100）
- DMSO, anhydrous (Sigma-Aldrich, cat. no. 276855)
- 无水 DMSO（Sigma-Aldrich，货号 276855）
DMSO 很容易透过皮肤和乳胶手套，并且可以促进溶解物质的身体吸收。避免直接接触。
- 1-Methyl-7-nitroisatoic anhydride (1M7; synthesis is described in refs.
- 1-甲基-7-硝基靛红酸酐（1M7)
1M7 应保存在 4 °C 的干燥器中。如果正确储存，1M7 的稳定性至少为 1 年。
- Dithiothreitol (DTT; Fisher BioReagents, cat. no. BP172-5)
- 二硫苏糖醇（DTT；Fisher BioReagents，目录号 BP172-5）
- Turbo DNase reaction buffer (10×; Life Technologies, cat. no. AM2238)
- Turbo DNase 反应缓冲液（10×；Life Technologies，目录号 AM2238）
- Turbo DNase (2 U/μl; Life Technologies, cat. no. AM2238)
- Turbo DNase（2 U/μl；Life Technologies，目录号 AM2238）
- RNeasy mini kit (Qiagen, cat. no. 74104)
- RNeasy mini kit（Qiagen，目录号 74104）
- Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs; 10 mM each nucleotide; New England BioLabs, cat. no. N0447S)
- 脱氧核苷酸三磷酸（dNTP；每个核苷酸 10 mM；New England BioLabs，目录号 N0447S）
- SuperScript II reverse transcriptase (200 U/μl; Life Technologies, cat. no. 18064-014)SuperScript II
- 逆转录酶（200 U/μl；Life Technologies，目录号 18064-014）
- Reverse transcription primer (custom synthesis)
- 逆转录引物（定制合成）
- Random nonamers (New England BioLabs, cat. no. S1254S)
- 随机九聚体（New England BioLabs，目录号 S1254S）
- LNA+ primers (custom synthesis)
- LNA+ 引物（定制合成）
- Q5 reaction buffer (5×; New England BioLabs, cat. no. M0493S)
- Q5 反应缓冲液（5×；New England BioLabs，目录号 M0493S）
- Q5 hot start high-fidelity DNA polymerase (2,000 U/ml; New England BioLabs, cat. no. M0493S)
- Q5 热启动高保真 DNA 聚合酶（2,000 U/ml；New England BioLabs，目录号 M0493S）
- Step 1 PCR primers (Integrated DNA Technologies, custom synthesis; see Reagent Setup and Tables 3 and 4)
- 第 1 步 PCR 引物（集成 DNA 技术，定制合成；参见试剂设置和表 3 和 4）
Table 3 Primer sequences for simple RNA-specific library construction.表3 用于简单RNA特异性文库构建的引物序列。
Primer name | Sequence (5′–3′) | Purpose | Comments |
GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNN [RNA-specific] | Appends partial Illumina adapter to the 5′ end of the amplicon将部分Illumina接头附加到扩增子的5′端 | [RNA-specific] 是目标 RNA 特异性的 15 至 20 nt 序列，与目标 RNA 具有相同的意义 | |
CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN [RT primer] | Appends partial Illumina adapter to the 3′ end of the amplicon
将部分Illumina接头附加到扩增子的3'端 | [RT primer]是适当的反义序列，通常与逆转录引物相同 | |
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [Barcode] GTGACTGGAGTTCAGAC | Completes the Illumina adapter on the 5′ end of the amplicon
完成扩增子5′端的Illumina接头 | [Barcode]是一个 6-nt 序列标识符，用于启用样本多路复用。有关条形码序列，请参阅表 4 | |
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCG | Completes the Illumina adapter on the 5′ end of the amplicon
完成扩增子5′端的Illumina接头 |
Table 4 Barcode sequencesa for simple two-step library construction.表 4 barcode序列用于简单的两步文库构建。
Index | [Barcode] | [Barcode] reverse compliment |
1 | 5′-CGTGAT-3′ | 5′-ATCACG-3′ |
2 | 5′-ACATCG-3′ | 5′-CGATGT-3′ |
3 | 5′-GCCTAA-3′ | 5′-TTAGGC-3′ |
4 | 5′-TGGTCA-3′ | 5′-TGACCA-3′ |
5 | 5′-CACTGT-3′ | 5′-ACAGTG-3′ |
6 | 5′-ATTGGC-3′ | 5′-GCCAAT-3′ |
7 | 5′-GATCTG-3′ | 5′-CAGATC-3′ |
8 | 5′-TCAAGT-3′ | 5′-ACTTGA-3′ |
9 | 5′-CTGATC-3′ | 5′-GATCAG-3′ |
10 | 5′-AAGCTA-3′ | 5′-TAGCTT-3′ |
11 | 5′-GTAGCC-3′ | 5′-GGCTAC-3′ |
12 | 5′-TACAAG-3′ | 5′-CTTGTA-3′ |
13 | 5′-TTGACT-3′ | 5′-AGTCAA-3′ |
14 | 5′-GGAACT-3′ | 5′-AGTTCC-3′ |
15 | 5′-TGACAT-3′ | 5′-ATGTCA-3′ |
16 | 5′-GGACGG-3′ | 5′-CCGTCC-3′ |
18 | 5′-GCGGAC-3′ | 5′-GTCCGC-3′ |
19 | 5′-TTTCAC-3′ | 5′-GTGAAA-3′ |
20 | 5′-GGCCAC-3′ | 5′-GTGGCC-3′ |
21 | 5′-CGAAAC-3′ | 5′-GTTTCG-3′ |
22 | 5′-CGTACG-3′ | 5′-CGTACG-3′ |
23 | 5′-CCACTC-3′ | 5′-GAGTGG-3′ |
25 | 5′-ATCAGT-3′ | 5′-ACTGAT-3′ |
27 | 5′-AGGAAT-3′ | 5′-ATTCCT-3′ |
1. Oligonucleotide sequences © 2007–2013 Illumina, Inc.
2. Index numbers are assigned by Illumina; indices 17, 24 and 26 are not available.
索引号由Illumina分配; 指数 17、24 和 26 不可用。
- Step 2 PCR primers (Integrated DNA Technologies, custom synthesis; see Reagent Setup and Tables 3 and 4)
- Amplicon PCR primers; the use of a primer design tool such as Primer-BLAST3858 is recommended to reduce offtarget primer binding (Integrated DNA Technologies, custom synthesis)
- G-25 micro spin columns (GE Healthcare, cat. no. 27-5325-01)
- G-25 微离心柱（GE Healthcare，货号 27-5325-01）
- PureLink PCR micro kit (Life Technologies, cat. no. K310250)
- PureLink PCR micro 试剂盒（Life Technologies，货号 K310250）
- Tagment DNA buffer (Illumina, cat. no. FC-131-1024)
- 标记 DNA 缓冲液（Illumina，货号。FC-131-1024）
- Amplicon Tagment mix (Illumina, cat. no. FC-131-1024)
- Amplicon Tagment 混合物（Illumina，货号。FC-131-1024）
- Nextera XT PCR master mix (Illumina, cat. no. FC-131-1024)
- Nextera XT PCR预混液（Illumina，货号）FC-131-1024）
- Nextera XT index 1 primers (Illumina, cat. no. FC-131-1002)
- Nextera XT index 1 引物（Illumina，货号。FC-131-1002）
- Nextera XT index 2 primers (Illumina, cat. no. FC-131-1002)
- Nextera XT index 2 引物（Illumina，货号。FC-131-1002）
- Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, cat. no. A63880)
- Agencourt AMPure XP 珠子（Beckman Coulter，货号 A63880）
- Absolute ethanol (Fisher BioReagents, cat. no. BP2818-500)
- 无水乙醇（Fisher BioReagents，货号。BP2818-500）
- NEBNext second strand synthesis reaction buffer (10×; New England BioLabs, cat. no. E6111S)
- NEBNext第二链合成反应缓冲液（10×;New England BioLabs，猫。不。E6111S）
- NEBNext second strand synthesis enzyme mix (New England BioLabs, cat. no. E6111S)NEBNext
- 第二链合成酶混合物（New England BioLabs，货号 E6111S）
- Qubit dsDNA high-sensitivity assay kit (Life Technologies, cat. no. Q32854)Qubit
- dsDNA 高灵敏度检测试剂盒（Life Technologies，货号 Q32854）
- Bioanalyzer high-sensitivity DNA kit (Agilent Technologies, cat. no. 5067-4626)
- 生物分析仪高灵敏度 DNA 试剂盒（Agilent Technologies，货号 5067-4626）
试剂配制及注意事项
3.3× folding buffer
- 3.3× folding buffer is 333 mM HEPES (pH 8.0), 333 mM NaCl and 33 mM MgCl2. This solution is suitable for refolding many in vitro–transcribed RNAs. The buffer components, ionic strength and ion type can all be varied to produce the desired probing conditions, provided that the buffer concentration exceeds the final SHAPE reagent concentration and that the pH is in the range of 7.4–8.3. This solution is stable at room temperature (∼25 °C) for at least 6 months.
- 3.3×折叠缓冲液为333mM HEPES（pH 8.0），333mM NaCl和33mM MgCl2。该溶液适用于重新折叠许多体外转录的 RNA。缓冲液组分、离子强度和离子类型都可以改变，以产生所需的探测条件，前提是缓冲液浓度超过最终的SHAPE试剂浓度，并且pH值在7.4–8.3的范围内。该溶液在室温 （∼25 °C） 下可稳定保存至少 6 个月。
10× denaturing control buffer
- 10× denaturing control buffer is 500 mM HEPES (pH 8.0) and 40 mM EDTA.
- 10×变性对照缓冲液为500mM HEPES（pH 8.0）和40mM EDTA。
该缓冲液必须不受二价离子（如 Mg2+）的污染，二价离子在加热时会导致 RNA 快速降解。该溶液在室温下可稳定保存至少 6 个月。
This buffer must be free of contamination by divalent ions such as Mg2+ that will cause rapid RNA degradation when heated. This solution is stable at room temperature for at least 6 months.
5× MaP prebuffer
- 5× MaP prebuffer is 250 mM Tris (pH 8.0), 375 mM KCl, 50 mM DTT and 2.5 mM each dNTP. This solution is stable for months at −20 °C, but it is intolerant of freeze-thaw cycles. Storage of small aliquots at −20 °C is recommended. Discard the buffer after five freeze-thaw cycles.
- 5× MaP 预缓冲液为 250 mM Tris （pH 8.0）、375 mM KCl、50 mM DTT 和 2.5 mM 每个 dNTP。
- 该溶液在-20°C下可稳定数月，但不能耐冻融循环。建议在-20°C下储存小等分试样。五次冻融循环后丢弃缓冲液。
2.5× MaP buffer
- 2.5× MaP buffer is 125 mM Tris (pH 8.0), 187.5 mM KCl, 15 mM MnCl2, 25 mM DTT and 1.25 mM dNTPs. Prepare this solution immediately before use by combining equal volumes of 5× Map prebuffer and 30 mM MnCl2. Freshly prepare the buffer before each use; oxidation of manganese renders this solution useless within hours.
- 2.5× MaP 缓冲液为 125 mM Tris （pH 8.0）、187.5 mM KCl、15 mM MnCl2、25 mM DTT 和 1.25 mM dNTP。
- 使用前立即通过混合等体积的 5× Map 预缓冲液和 30 mM MnCl2 来制备该溶液。每次使用前新鲜制备缓冲液;锰的氧化使该溶液在数小时内无用。
Modified RT-PCR primers for small RNA workflow
- After reverse transcription, PCR is performed in two steps; see Tables 3 and 4 for appropriate sequences. The first PCR step is performed using Step1Fwd and Step1Rev primers, where [RNA-specific] is a 15–20-nt sequence specific to, and in the same sense as, the RNA of interest and [RT primer] is an appropriate antisense sequence (this is typically the same sequence as the reverse transcription primer; it may be an RNA-specific sequence if random primers were used). A randomized 5-nt sequence immediately 5′ to the RNA-specific sequence is required for optimal cluster identification on Illumina instruments.
- 第一个 PCR 步骤使用 和 引物进行
- [RNA-specific] 是对目标 RNA 具有特异性的 15-20-nt 序列，并且与目标 RNA 具有相同的意义
- [RT primer] 是适当的反义序列（这通常与逆转录引物相同的序列;如果使用随机引物，则可能是 RNA 特异性序列）。在Illumina仪器上，需要紧邻RNA特异性序列5′的随机化5-nt序列，以实现最佳簇鉴定。
- The second PCR step is performed using the 'universal' primers UniFwd and UniRev, where [Barcode] is a 6-nt sequence identifier to enable sample multiplexing. These primers do not require complementarity to the RNA of interest; a single set can be purchased and used with any RNA. Note that the reverse complement of the [Barcode] sequence will be read by Illumina sequencers and used for demultiplexing. Thus, it is important to use the reverse complement of the [Barcode] sequence when configuring the sequencing run.
- 第二个 PCR 步骤使用“通用”引物 和 进行
- 其中 [Barcode] 是 6-nt 序列标识符，用于启用样品多路复用。这些引物不需要与目标RNA互补;可以购买单套并与任何 RNA 一起使用。
- 请注意，[Barcode]序列的反向补码将由Illumina测序仪读取并用于解复用。因此，在配置测序运行时，使用 [Barcode] 序列的反向补码非常重要。